同样做双荧光检测，为什么结果跟师兄差这么多？-盎真小谈

最近做了一个多月的双荧光素酶报告基因检测。荧光值低，转染效率低，重现性差……很明显，哥们做的步骤完全一样。为什么结果如此不同？皮典皮典跑去问我的学长，谁知道他直接给了我一套实验方案和常见问题的分析和解答。我受宠若惊，再也不用担心实验问题了。

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萤光素酶是自然界中能产生生物发光的酶的总称。最具代表性的是萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶）。萤光素酶可催化萤光素氧化为氧化萤光素。在荧光素氧化过程中，它会发出生物荧光。荧光素氧化过程中释放的生物荧光可以通过荧光计测量。

双荧光素酶报告基因检测实验包括萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶两种荧光素酶[1]。这两种荧光素酶以不同的方式起作用。一是底物和辅因子不同。萤火虫萤光素酶需要萤光素、O2、ATP 和 Mg2+，而海肾萤光素酶只需要腔肠素和 O2。二是发光颜色不同。萤火虫荧光素酶产生黄绿色光，发光波长为 560 nm；而海肾荧光素酶则产生发光波长为 465 nm 的蓝光。

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图1. 两种荧光素酶检测原理

实验方案

从双荧光素酶报告基因检测实验对亚结构开始分析验证，可以先验证启动子的基本序列，再验证核心区。实验的主要过程如下。

验证启动子序列

1. 分析启动子

根据现有资料，利用各种在线生物信息学软件，初步确定目标基因启动子可能位于的位置。

2、构建向量

在带有报告基因的质粒上构建预测序列以构建表达载体。载体通常使用pGL4.20载体和pRL系列载体。

3. 转染与表达

将待测质粒和含有海肾荧光素酶基因的质粒转入细胞，扩增表达荧光素酶。

4. 裂解检测

加入细胞裂解液，加入发光底物，用荧光检测器或酶标仪检测。

5. 统计分析

使用GraphPad Prism5等软件绘制和分析实验结果。

验证启动子的核心区域

为了找到目的基因启动子的核心区域，首先分析目的基因启动子区域的组成，构建目的基因启动子重要结构域的缺失。然后将构建的载体转染表达，裂解检测，最后对得到的数据进行统计分析，找出验证启动子的核心区域。

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图2 实验基本技术路线

常见问题及解决方案（DL101）

Q1低荧光值

可能的原因和解决方法如下：

可能的原因

解决方案

转染效率和表达效率低

多做预实验，优化转染条件：在质粒中加入GFP作为转染效率的验证。

操作不当

使用排炮，加入后立即进行测试；提前设置机器测试程序。

试剂储存不当

Luc 根据需要分装并储存在 -80°C，Renlia 底物储存在 -20°C，Renlia 预先溶解在乙醇中。注意乙醇挥发问题。

反应体系不合适

细胞裂解液：底物 = 1:5。如果减少底物用量，则需要减少Cell Lysis Solution的用量来平衡反应体系。

Q2 重复孔的重现性差

可能的原因及解决方法如下：

（1）实验平行重复孔（不同细胞孔）：影响不同孔间数值的因素很多。建议对同一细胞孔裂解物进行技术平行，以测试试剂的重现性。

(2) 同一细胞孔裂解液的重孔：注意实验操作、上样顺序、上样速度和上样量。检查排枪样品是否有不平整的地方。

(3) 尽可能控制从不同样品和基材混合到机器检测的时间间隔。

注：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏。多口井的数值存在一定差异是正常的，一般认为同一数量级的差异是可以接受的。

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